蛋白质免疫印迹实验样品制备及凝胶电泳理论介绍
样品制备
细胞裂解物是用于蛋白质印迹的最常见的样品形式。蛋白质提取试图收集细胞胞质中的所有蛋白质。这应该在低温下用蛋白酶抑制剂进行，以防止蛋白质变性。由于组织样品显示出更高程度的结构，因此需要机械发明，例如均质化或超声处理来提取蛋白质。
提取蛋白质后，了解提取物的浓度非常重要。这最终允许研究人员确保在等效的基础上比较样品。通常使用分光光度计测量蛋白质浓度。使用该浓度允许通过浓度，质量和体积之间的关系来测量加载到每个孔中的蛋白质的质量。
在确定适当体积的样品后，将其稀释到装载缓冲液中，其含有甘油，使得样品容易地沉入凝胶的孔中。跟踪染料（溴酚蓝）也存在于缓冲液中，使研究人员能够看到分离进展的程度。将样品稀释到装载缓冲液中后加热，以使高级结构变性，同时保留硫化物桥。使高结构变性可确保氨基酸的负电荷不被中和，使蛋白质在电场中移动（在电转移期间应用）。
对样本进行阳性和阴性对照也非常重要。对于阳性对照，使用已知的靶蛋白源，例如纯化的蛋白质或对照裂解物。这有助于确认蛋白质的特性和抗体的活性。阴性对照是无效细胞系，例如β-肌动蛋白，也用于确认染色不是非特异性的。
凝胶电泳
蛋白质印迹使用两种不同类型的琼脂糖凝胶：堆积和分离凝胶。较高的堆积凝胶是微酸性的（pH6.8）并且具有较低的丙烯酰胺浓度，形成多孔凝胶，其使蛋白质分离不良但允许它们形成薄的，清晰限定的条带。较低的凝胶，称为分离或解析凝胶，是碱性的（pH 8.8），具有更高的聚丙烯酰胺含量，使凝胶的毛孔更窄。因此，在这种凝胶中，蛋白质的大小更大，因为较小的蛋白质比较大的蛋白质更容易传播，因此也很快。
当加载在凝胶上时，蛋白质具有负电荷，因为它们已经通过加热变性，并且当施加电压时将朝向正电极行进。凝胶通常通过使用方案部分中描述的溶液将它们倒入两个玻璃或塑料板之间来制备。将样品和标记物加载到孔中，并向空孔中加载样品缓冲液。然后将凝胶连接到电源并允许其运行。电压非常重要，因为高电压会导致频带过热和失真。
细胞裂解物是用于蛋白质印迹的最常见的样品形式。蛋白质提取试图收集细胞胞质中的所有蛋白质。这应该在低温下用蛋白酶抑制剂进行，以防止蛋白质变性。由于组织样品显示出更高程度的结构，因此需要机械发明，例如均质化或超声处理来提取蛋白质。
提取蛋白质后，了解提取物的浓度非常重要。这最终允许研究人员确保在等效的基础上比较样品。通常使用分光光度计测量蛋白质浓度。使用该浓度允许通过浓度，质量和体积之间的关系来测量加载到每个孔中的蛋白质的质量。
在确定适当体积的样品后，将其稀释到装载缓冲液中，其含有甘油，使得样品容易地沉入凝胶的孔中。跟踪染料（溴酚蓝）也存在于缓冲液中，使研究人员能够看到分离进展的程度。将样品稀释到装载缓冲液中后加热，以使高级结构变性，同时保留硫化物桥。使高结构变性可确保氨基酸的负电荷不被中和，使蛋白质在电场中移动（在电转移期间应用）。
对样本进行阳性和阴性对照也非常重要。对于阳性对照，使用已知的靶蛋白源，例如纯化的蛋白质或对照裂解物。这有助于确认蛋白质的特性和抗体的活性。阴性对照是无效细胞系，例如β-肌动蛋白，也用于确认染色不是非特异性的。
凝胶电泳
蛋白质印迹使用两种不同类型的琼脂糖凝胶：堆积和分离凝胶。较高的堆积凝胶是微酸性的（pH6.8）并且具有较低的丙烯酰胺浓度，形成多孔凝胶，其使蛋白质分离不良但允许它们形成薄的，清晰限定的条带。较低的凝胶，称为分离或解析凝胶，是碱性的（pH 8.8），具有更高的聚丙烯酰胺含量，使凝胶的毛孔更窄。因此，在这种凝胶中，蛋白质的大小更大，因为较小的蛋白质比较大的蛋白质更容易传播，因此也很快。
当加载在凝胶上时，蛋白质具有负电荷，因为它们已经通过加热变性，并且当施加电压时将朝向正电极行进。凝胶通常通过使用方案部分中描述的溶液将它们倒入两个玻璃或塑料板之间来制备。将样品和标记物加载到孔中，并向空孔中加载样品缓冲液。然后将凝胶连接到电源并允许其运行。电压非常重要，因为高电压会导致频带过热和失真。
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